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> HEK293に発現する完全長CD20タンパク質
CD20はB細胞表面抗原として、プレB細胞と成熟したB細胞に発現しますが、前駆B細胞や成熟した形質細胞には発現しません。 また、CD20はB細胞由来のリンパ腫や白血病などの腫瘍細胞や炎症や免疫関連疾患に関与するB細胞に発現しているため、リンパ腫や白血病などの自己免疫疾患の治療標的にもなっています。
CD20分子を標的とした抗体医薬品は三つの世代開発されています。第一世代のヒト-マウスキメラ抗体のRitux*mabは代表的で、ヒト化が不十分なため、一部の患者には薬剤耐性や副作用が出ていました。第二世代ではヒト化修飾抗体のOfatumumabは代表的で、免疫原性を減少させ、副作用を抑制できましたが、抗体の特異性や抗原との親和性が低下します。第三世代はFcフラグメントグリコシル化修飾抗体でObinutuzumabが代表的で、抗体の特異性、抗原との結合親和性が高くなっているため、ADCCとADCP効果が増強されました。
モノクローナル抗体薬に限らず、CD20はCD3などの標的と結合することによって、二重特異性抗体を開発し、T細胞をB細胞の周囲に集めさせ、T細胞のB細胞に対する殺傷能力を促進します。
CD20を標的とした抗体医薬品の開発に、高品質の抗原が必要です。Genentechが2020年2月20日にScienceで「Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody Ritux*mab」という文章を発表しました。この文章では完全長CD20タンパク質と、Ritux*mab Fabsの複合体の三次元構造を分析されました。Ritux*mabはCD20に対し、認識部位が一次エピトープECL2のほか、二次エピトープECL1/ECL2も含まれています。SPRの検証によってRitux*mabは完全長CD20タンパク質と、ECL2ポリペプチドエピトープとの親和性が異なっており、Ritux*mabとCD20の親和性は二次エピトープECL1/ECL2に影響されることが確認されました。また、同文章で二次エピトープECL1 / ECL2はRitux*mabのCDC効果に影響を与えていることがわかり、構造が完全なCD20タンパク質の重要性を明らかにされました。（ページの下に上記の文章をダウンロードしていただけます。）
完全長CD20タンパク質の発現が難しくて、活性が不安定であるため、抗体の活性解析に適合するCD20タンパク質を入手することは困難です。弊社は独自な設計を用いて、HEK294にって発現される四回膜貫通型の完全長CD20タンパク質を作成しました。ビオチン標識、または標識のないNanodiscや、DDM、VLPなどが開発されています。完全長CD20タンパク質はsmall loopとbig loopを同時に持ち、完全構造の天然コンフォメーションであり、免疫/ ELISA/ SPR/ BLI/ FACSに利用できます。Ritux*mab、Ofatumumabと完全長CD20タンパク質の結合活性は検証済みで、完全長CD20タンパク質はナノモルレベルの高親和性です。またプロトコルを無償で提供しております。
DDMは非イオン性可溶化剤で、脂質膜を分解し膜タンパク質を放出し、溶液の中で膜が除去された膜タンパク質に疎水性の環境を提供し、膜タンパク質の疎水性の膜貫通型セグメントを維持し、保護できます。ただし、DDMは細胞膜を壊す可能性があるため、一般的に細胞実験には利用されていません。
ナノディスク（Nanodisc）は膜足場タンパク質（MSP）とリン脂質分子で構成されたリン脂質二重膜構造です。膜タンパク質をナノディスクの特殊な構造に挿入できます。生物活性が保て、可溶性も良好なので、よく利用されています。弊社が使っているNanodisc技術は特許使用権を取得しておるので、バイオ医薬品の研究や開発にご安心して利用いただけます。
VLP (Virus like particles、ウイルス様粒子) テクノロジープラットフォームを用いて、完全なコンフォメーションを持っている膜タンパク質を細胞の表面に集合させ、抗体免疫とスクリーニングに利用できるよう、複雑な構造の膜タンパク質を可溶で高濃度のタンパク質に変えます。作られたエンベロープVLPsは細胞膜上に正しく折りたたまれた複数回膜貫通型タンパク質を提示し、それによって標的になる天然コンフォメーションを識別する抗体を誘導し、スクリーニングできます。
A) HEK293 Cell (Full Length)
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-3 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
B) E.coli (Extracellular)
Immobilized RTX at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20, TrxA Tag, His Tag (E.coli) with a linear range of 78-2500 ng/mL.
2e5 of CD20-CAR-293 cells transfected with anti-CD20-scFv were stained with 100 μL of 3 μg/mL of Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (Cat. No. CD0-H82E3) and negative control protein respectively, washed and then followed by PE-SA and analyzed with FACS (QC tested).
2e5 of CD20-CAR-293 cells transfected with anti-CD20-scFv were stained with 100 μL of 3 μg/mL of Human CD20 / MS4A1 Full Length Protein, His Tag (Nanodisc) (HEK293)(Cat. No. CD0-H52H1) and negative control protein respectively, washed and then followed by PE anti-His antibody and analyzed with FACS (QC tested).
Immobilized RTX at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (Cat. No. CD0-H82E3) with a linear range of 0.008-0.125 μg/mL
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag (Cat. No. CD0-H52H1) with a linear range of 1-63 ng/mL
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) with a linear range of 4-63 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Immobilized anti-CD20 antibody at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) with a linear range of 4-63 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-3 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Immobilized anti-CD20 antibody at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-6 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Biotinylated Human CD20, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) captured on Biotin CAP-Series S Sensor Chip can bind RTX with an affinity constant of 1.73 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore T200).
Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) captured on CM5 chip via Anti-human IgG Fc antibodies surface can bind RTX with an affinity constant of 6.21 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore 8K).
Authors: Lionel Rougé et al.
Journal: Science.aaz9356
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